CRISPR-Cas9基因编辑技术的引入，使得全基因组水平上的高通量筛选成为可能。通过基因敲除，可以系统地识别毒素的作用靶点，从而为解毒剂的开发提供理论依据。然而，单靠CRISPR筛选并不足以直接找到有效的解毒药物。因此，迫切需要一种结合毒素作用机制研究和药物筛选的新方法，以加速解毒剂的开发过程。2024年5月30日，中山大学药学院王巧平和万国辉团队在Nature Protocols期刊上发表了一篇名为：Integrating genome-wide CRISPR screens and in silico drug profiling for targeted antidote development的论文。该论文共同第一作者是中山大学药学院的Bei Wang, Yu Xu, Arabella H. Wan。该论文建立了一种系统框架，结合全基因组CRISPR筛选和虚拟药物筛选，旨在发现针对毒素的新型解毒剂。这种方法不仅可以全面理解毒素的分子机制，还能迅速筛选和验证已知安全有效的药物，从而大大缩短解毒剂开发的时间。
专业知识需求任何有细胞培养经验的科学家都可以应用CRISPR筛选。实验所需的设备在大多数细胞培养设施中都有，试剂可以从标准科学供应商处购买。虚拟筛选则需要科学家具备Linux和Python基本操作的知识。实验设计1. CRISPR筛选：– 表型选择：需要确定与目标表型相关的sgRNA的分离方法，常见表型是细胞活力，毒素通常会引起细胞死亡。在某些情况下，毒素可能会引起细胞形态或生理功能的变化，需要使用其他方法分离细胞，如使用细胞筛网或荧光标记蛋白。- 细胞模型选择：理想情况下应使用毒素作用的初级细胞系，但大多数CRISPR筛选使用癌细胞系，因为它们更易扩增。HAP1细胞（人类单倍体细胞系）由于其单拷贝基因组的优势，也被广泛用于筛选。此外，在不同细胞系中验证候选基因是至关重要的。- sgRNA库：常用的基因组范围的库包括GeCKO v2和Brunello库，这些库可以从Addgene等资源库或商业来源获得。较小的定制库适用于特定途径或生物过程的研究。- 慢病毒生产和细胞转导：大多数筛选中使用慢病毒递送sgRNA库，保持低MOI以确保每个细胞仅携带一个稳定整合的sgRNA，同时保持足够的覆盖率以防止sgRNA丢失。- 选择条件：根据筛选表型设定筛选条件，如毒素剂量或FACS分选标准。建议为每组（如对照组和毒素处理组）设定2至4个生物重复，以提高结果的可靠性。2. 筛选结果分析：– 使用MAGeCK等生物信息学算法分析筛选结果，选择显著变化的基因进行进一步的基因本体（GO）和路径分析。3. 候选基因验证：– 为验证筛选中识别的候选基因，需要使用单独的sgRNA进行基因扰动，并通过定量PCR和西方印迹分析敲除效率。还可以使用shRNA或siRNA敲低基因表达进行验证。- 药理抑制剂也可以用来快速验证这些基因是否为实际的药物靶点。4. 虚拟药物筛选：– 如果已有的市场药物可以作为抑制剂，这些药物可以直接测试其解毒效果。如果没有现成的药物，可以使用虚拟筛选技术在市场上已有的药物中寻找潜在抑制剂。5. 体外药物验证：– 对筛选出的药物，选择一系列不同浓度以确定其最佳解毒效果和安全性，初始测试浓度通常为10 μM，但具体浓度需根据化合物的特性和实验需求确定。
图1 | 实验时间表和概述。基因组规模的Cas9敲除质粒库被包裹在慢病毒中（阶段1），然后转导到目标野生型（WT）细胞中（阶段2），以建立用于后续筛选的sgRNA库表达细胞。随后，根据筛选目标施加选择压力（阶段3）。在预定的时间间隔内，提取基因组DNA以扩增sgRNA区域（阶段4）。接下来，通过下一代测序和严格的统计分析，识别出被扰动的候选基因（阶段5）。这些候选基因将进一步验证（阶段6）。在成功确认后，候选基因编码的蛋白质与分子库一起进行虚拟筛选（阶段7）。选择排名靠前的分子进行后续的体外药物测试（阶段8）。该论文提供了具体的操作步骤，包括在HAP1细胞中执行全基因组CRISPR–Cas9敲除筛选毒素的详细指导，以及进行虚拟药物筛选和体内药物验证的步骤。使用该协议进行研究，大约需要4周时间完成全基因组筛选，4周进行测序和数据分析，4周验证候选基因，1周进行虚拟筛选，2周进行体外药物验证。小结总之，研究人员结合了全基因组CRISPR筛选新药物靶点和虚拟筛选美国食品药品监督管理局批准的药物的方法，从而全面了解毒素在全基因组水平的机制，并识别出有前景的解毒药物靶向特定分子。该框架有潜力加速各种毒素解毒剂的开发，并迅速识别已知安全有效的药物候选物。这种方法比传统方法更快地开发新解毒剂，保护人类免受多种毒素的威胁，促进人类健康的发展。研究团队简介
王巧平中山大学药学院（深圳）“百人计划”教授、博导。2010年获中山大学与伦敦卫生与热带医学学院博士学位，2011-2017年在澳大利亚Garvan医学研究所及悉尼大学从事博士后研究。发表15篇高水平论文，总影响因子131，被引用超1000次，研究成果被约50家国际主流媒体报道。曾获多项国际奖项并担任澳大利亚NHMRC基金评审人。
万国辉中山大学药学院教授、博士生导师，中山大学“百人计划”中青年杰出人才，国家优秀青年基金和广东省杰出青年基金获得者。主要研究方向为肿瘤耐药、肿瘤免疫和抗肿瘤创新药物。发表研究论文30余篇，其中1篇入选ESI高被引论文，1篇被F1000推荐。拥有1项中国发明专利。
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来源：BioMed科技